UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS HUMANAS E NATURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Caracterização molecular de três espécies de Trachycephalus (Anura: Hylidae): investigando potenciais híbridos interespecíficos Fernanda Couto Zaidan Vitória, ES Abril, 2014 UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS HUMANAS E NATURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Caracterização molecular de três espécies de Trachycephalus (Anura: Hylidae): investigando potenciais híbridos interespecíficos Fernanda Couto Zaidan Orientadora: Valéria Fagundes Coorientadora: Leonora Pires Costa Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biologia Animal) da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Biologia Animal Vitória, ES Abril, 2014 AGRADECIMENTOS Expresso meus sinceros agradecimentos a todos que ajudaram na conclusão desta jornada. Obrigada Profª. Drª. Valéria Fagundes, que abriu as portas do Laboratório de Genética Animal para mim e possibilitou o meu “retorno” à ciência, me mostrou como ser uma profissional dedicada e ética e, mais que tudo, esteve disponível para me apoiar em momentos de incertezas e também para celebrarmos momentos de alegrias. Agradeço à minha co-orientadora Profª. Drª. Leonora Pires Costa, pelas contribuições para o melhor desenvolvimento do meu projeto. Agradeço aos Profs. Drs. Marcelo Vallinoto, Yuri Leite e aos suplentes por aceitarem participar como membros avaliadores da minha dissertação. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Espírito Santo (FAPES), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Universidade Federal do Espírito Santo (UFES) pelo financiamento do projeto, bolsa de mestrado e suporte. Aos professores do PPGBAN que se dedicaram para contribuir com a minha formação. Aos amigos do Laboratório de Genética Animal (LGA): Ana Heloisa de Carvalho, Arturo Martinelli, Cristina Massariol, Daniele Angeli, Débora Dalvi, Gabriel Dalbem, Lorena Dinelli, Lucas Vianna, Mariana Azevedo, Marianna Machado, Marina Monjardim, Rosana Nunes, Sílvia Caldara, Thaís Volpi, Victor Colombi, Yuri Marins e demais que por lá passaram, pela troca de experiências e bons momentos. Em especial à ao Eduardo Muhl, por se dispor a subir o Mestre Álvaro para coletarmos. À todos os colegas de mestrado, em especial Bruna Fonseca, Jeronymo Dalapicolla e Letícia Zanchetta, por servirmos de apoio mútuo nas dificuldades da biologia molecular. Ao colega João Felipe Tonini, que me apresentou aos Trachycephalus e suas problemáticas e sempre se mostrou disposto a compartilhar novos conhecimentos. Ao colega Edicarlos Pralon, que foi fundamental nas coletas no topo do Mestre Álvaro e em Costa Bela, e sacrificou alguns de seus finais de semana para ajudar uma pessoa que ele mal conhecia. Ao colega João Gasparini, que também, sem me conhecer pessoalmente, facilitou meu contato com importantes herpetólogos. Aos diversos pesquisadores que me doaram amostras de tecido dos Trachycephalus e que sanaram minhas dúvidas muitas vezes: Prof. Dr. Miguel Trefaut Rodrigues, Prof. Dr. Célio F. B. Haddad, Prof. Dr. Renato Feio, Prof. Dr. José Pombal Jr., Prof. Dr. Guarino R. Colli, Profª. Drª. Teresa Cristina Ávila Pires, Prof. Dr. Eduardo Ferreira e Profª. Drª. Juliana Zina. Principalmente agradeço a todos os coletores e curadores das respectivas coleções de tecidos, pois sem vocês esse trabalho não seria possível. À Juliana Justino, do Núcleo de Genética Aplicada à Conservação da Biodiversidade, por proporcionar um ambiente adequado de trabalho e por ser sempre tão prestativa e gentil ao me ajudar a entender o que os produtos de PCR queriam dizer. Aos meus pais Elizabeth e Salim, por me apoiarem em todos os aspectos da minha vida e por serem referências de valores, amor e respeito. Vocês tornaram possível a realização de mais um sonho e têm minha eterna gratidão por terem me dado a vida, por cuidarem de mim e me ajudarem a ter equilíbrio e persistência em mais essa etapa. Obrigada Gláucio, por acreditar em mim e em nós, como parceiros de vida. Você quem motivou minha vinda a Vitória e possibilitou a criação de laços de amizade e raízes aqui. Tenho muito orgulho de você e o admiro por sempre buscar melhorar como pessoa e profissional. Agradeço também pela paciência em adaptar e melhorar minhas figuras, o que ajudou a enriquecer este trabalho. Aos amigos, que, apesar da saudade, reconhecem que não precisamos estar perto para que nos sintamos conectados. Enfim, a amizade de vocês me faz lembrar sempre que as coisas da vida são melhores quando compartilhadas. Muito obrigada. Aos meus pais, sempre amorosos e presentes. SUMÁRIO I. INTRODUÇÃO................................................................................................. 01 II. OBJETIVOS E METAS.................................................................................. 06 II.1. Objetivo Geral........................................................................................ 06 II.2. Metas...................................................................................................... 06 III. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 07 III.1. Amostra................................................................................................. 07 III.2. Extração, amplificação e sequenciamento de DNA.............................. 08 III.3. Análise dos dados.................................................................................. 11 III.3.1. Avaliação da identidade molecular das espécies e dos indivíduos.............................................................................................. 11 III.3.2. Verificação da ocorrência de híbridos interespecíficos.......... 13 IV. RESULTADOS................................................................................................ 15 IV.1. Identidade molecular das espécies........................................................ 15 IV.2. Potenciais híbridos interespecíficos..................................................... 23 V. DISCUSSÃO..................................................................................................... 35 VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 49 VIII. APÊNDICES................................................................................................ 55 VIII.1. Apêndice I.......................................................................................... 55 VIII.2. Apêndice II......................................................................................... 60 Lista de Tabelas Tabela 1. Número de localidades por estado (nL) e de indivíduos (n) de cada espécie de Trachycephalus analisadas no presente estudo...................... 09 Tabela 2. Concentrações e quantidades dos reagentes e primers utilizados nas reações de PCR de cada gene e perfis das PCRs....................................... 10 Tabela 3. Relação do número de sequências geradas por espécie nos genes mitocondriais COI e ND2 e no gene nuclear Tirosinase................................. 15 Tabela 4. Distância genética intraespecífica (diagonal) e interespecífica (cinza) para os genes ND2, COI e Tirosinase das espécies T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni)................................. 18 Tabela 5. Polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) para os genes ND2, COI e TYR exclusivos de T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni) e que são diferentes entre as três.............................. 19 Tabela 6. Polimorfismos de nucleotídeos únicos que caracterizam as espécies T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni) no gene ND2........................................................................................... 19 Tabela 7. Polimorfismos de nucleotídeos únicos que caracterizam as espécies T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni) no gene COI.…....................................................................................... 20 Tabela 8. Polimorfismos de nucleotídeos únicos que caracterizam as espécies T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni) no gene TYR.......................................................................................... 20 Tabela 9. Conjunto de evidências dos potenciais indivíduos híbridos, incluindo a identificação morfológica de cada indivíduo, as identificações nos genes COI e ND2 (DNAmt) e na tirosinase (DNAn) nas análises filogenéticas, pelas distâncias interespecíficas e na comparação com os SNPs espécie-específicos................................................................................ 29 Tabela 10. Distância genética intraespecífica (cinza) e interespecífica (rosa) para os genes ND2, COI e Tirosinase das espécies T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni). A distância genética entre os haplótipos observados dos potenciais híbridos em relação às espécies parentais são apresentadas em verde............................................................... 30 Tabela 11. Identificação dos potenciais híbridos por meio de SNPs espécie-específicos. Em vermelho T. mesophaeus =Tme, em verde T. nigromaculatus=Tni,em azul T. typhonius=Tty e em cinza alelos de T. typhonius e T. nigromaculatus......................................................................................... 32 Lista de Figuras Figura 1. Exemplares típicos de T. mesophaeus, T. nigromaculatus e T. typhonius e distribuição geográfica de cada espécie, hachurado em cinza, (Haddad et al. 2013 Os pontos são as localidades amostradas .................................................................................... 05 Figura 2. Vista lateral (indivíduo JFT 473) e dorsal (indivíduo LGA3924) de potenciais híbridos de Trachycephalus.....................................…………............................................... 08 Figura 3. Pico duplo em eletroferograma do gene tirosinase indicando heterozigose na posição 144 (quadrado). Y=C+T segundo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)………………………………………………………………………... 13 Figura 4. Árvores filogenéticas do gene ND2, COI e TYR. Valores acima dos ramos correspondem ao suporte da ML e probabilidades posteriores da IB, respectivamente......... 17 Figura 5. Árvores filogenéticas dos genes ND2, COI e Tirosinase concatenados. Valores acima dos ramos correspondem ao suporte da ML e probabilidades posteriores da IB, respectivamente................................................................................................................... 17 Figura 6. Rede de haplótipos dos genes COI, ND2 e Tirosinase. A frequência dos haplótipos é proporcional ao tamanho dos círculos. Círculos pretos representam haplótipos intermediários gerados pelo programa. O tamanho das linhas é proporcional ao número de passos mutacionais (até 5 passos). Números acima das barras representam o número de passos mutacionais (exceto na tirosinase) e corresponde, em sua maioria, a um único passo mutacional............................................................................................................................... 22 Figura 7. Árvores de haplótipos dos genes ND2 e COI com os indivíduos de morfologia intermediária e os demais exemplares que apresentaram incongruências citonucleares Tty = T. typhonius, Tme= T. mesophaeus e Tni= T. nigromaculatus......................................................................................................................... 27 Figura 8. Árvore da tirosinase com destaque para o posicionamento dos alelos dos prováveis híbridos (indicado pelo número do haplótipo). Os espécimes que tiveram alelos agrupados com espécies diferentes estão destacados com um asterisco. Ver haplótipos no Apêndice II............................................................................................................................... 28 Figura 9. Rede de haplótipos dos genes COI, ND2 e Tirosinase com os indivíduos híbridos. Verde representa os haplogrupos de T. nigromaculatus (Tni), vermelho T. mesophaeus (Tme) e azul T. typhonius (Tty). Os haplótipos dos indivíduos híbridos estão indicados pelas cores na legenda, com distinção do DNA mitocondrial (DNAmt) e DNAnuclear DNAn)................................................................................................................ 31 Figura 10. Correspondência dos SNPs espécie-específicos de T. mesophaeus (vermelho), T. typhonius (azul) e T. nigromaculatus (verde) com os indivíduos híbridos em relação ao DNA mitocondrial e DNA nuclear...................................................................................................................................... 32 Figura 11. Possíveis heredogramas dos indivíduos híbridos, representados pelos losangos. Os círculos representam o indivíduo materno e o retângulo o paterno. A primeira linha dentro de cada figura geométrica indica o DNAmt e a segunda linha indica o DNAn. As siglas indicam T. nigromaculatus (Tni), T. mesophaeus (Tme) e T. typhonius (Tty). F1 seria primeira geração e F2 seria segunda geração ou posterior................................................................................................................................... 33 Figura 12. Mapa com distribuições das espécies T. mesophaeus (área hachurada), T. 34 1 nigromaculatus (área cinza escuro) e T. typhonius (área cinza clara), com localidades dos possíveis híbridos (círculos). Destacados pelas setas estão os híbridos em que uma das possíveis espécies parentais não é conhecida para a localidade. No caso dos indivíduos de Baixa Grande do Ribeiro/PI e Chapada dos Guimarães/MT não ocorre T. nigromaculatus e nos indivíduos da Serra/ES não há registros de T. typhonius para o Espírito Santo. O genoma dos indivíduos está representado pelas cores das respectivas espécies nos círculos, sendo o lado esquerdo correspondente ao DNAmt e o lado direito os alelos do DNAn....................................................................................................................................... Figura 13. Relações filogenéticas entre oito espécies de Trachycephalus, incluindo T. mesophaeus, T. nigromaculatus e T. typhonius. Os valores sobre os ramos são os tempos de divergências dos clados e os valores em frente aos nós são o bootstrap da análise de Máxima Verossimilhança (Adaptado de Pyron e Wiens 2013)............................................... 36 Resumo Animais híbridos representam um desafio à taxonomia e sistemática, pois correpondem a unidades evolutivas geralmente sem clara delimitação morfológica, comportamental e genética. Híbridos podem ser morfologicamente intermediários aos parentais ou, devido à introgressão e retrocruzamentos, suas características podem se misturar tornando difícil sua identificação. Uma das formas de identificação de híbridos é por meio de ferramentas de biologia molecular, que ao utilizarem marcadores de DNA mitocondrial (herança exclusiva materna) e DNA nuclear (herança materna e paterna), permitem a comparação entre informações genéticas. Além da hibridização existem outras fontes de conflito entre dados moleculares provenientes do DNA mitocondrial e DNA nuclear, como por exemplo a retenção de polimorfismos ancentrais. Em localidades do Espírito Santo, Brasil, foram coletados indivíduos de morfologia distinta de Trachycephalus mesophaeus e T. nigromaculatus, que são as únicas espécies do gênero conhecidas nesse estado. Porém, estudos piloto usando o gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (COI) agruparam esses espécimes com amostras de T. typhonius. Devido a estas incongruências, foram sequenciados fragmentos de dois genes mitocondriais - COI e Nicotinamida Desidrogenase subunidade 2 (ND2) e um exon nuclear (tirosinase) de 173 indivíduos de Trachycephalus, de forma a esclarecer as identificações taxonômicas e investigar a correspondência entre caracteres morfológicos e genéticos nesta linhagem, na sua área de ocorrência As filogenias moleculares, divergências genéticas, redes de haplótipos e polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) confirmaram as três espécies acima mencionadas como linhagens evolutivas distintas e revelaram mais sete indivíduos potencialmente híbridos, mas morfologicamente assinalados a T. mesophaeus, T. nigromaculatus ou T. typhonius.. Devido à taxa de evolução lenta da tirosinase, as espécies mais recentes T. typhonius e T. nigromaculatus parecem não terem sido sorteadas completamente nesse gene. Já T. mesophaeus, que é a espécie mais antiga das três, foi recuperada inequivocamente em todas as análises. De forma inédita, as análises moleculares evidenciaram a ocorrência de introgressão bidirecional entre T. nigromaculatus e T. typhonius e entre T. nigromaculatus e T. mesophaeus, sendo que há indícios de indivíduos F1 (cruzamentos entre espécies parentais puras gerando híbridos). A utilização do gene ND2 mostrou-se mais eficiente do que o gene COI nas filogenias e, apesar da tirosinase ser um gene nuclear de evolução lenta, contribuiu para a identificação de incongruências citonucleares. Nossos resultados mostram que a história filogenética de Trachycephalus é complexa e que o uso de marcadores nucleares de evolução mais rápida e ampliação dessas análises para outras espécies do gênero podem revelar mais eventos de hibridização. Palavras-chave: Hibridação, polimorfismo, marcadores genéticos, anfíbio. Abstract Hybrids are evolutionary units generally without clear morphological, behavioral and genetic delimitation, thus representing a challenge to taxonomy and systematics. They can morphologically resemble their parents or, due to introgression, their characteristics can be diluted with a prevailing appearance of one of the parental species, which could hinder identification. One way to identify hybrids is through molecular biology tools, such as mitochondrial DNA (maternal inherintance exclusively) and nuclear DNA (maternal and paternal inheritance), allowing genetic comparisons. Besides hybridization, conflicting mtDNA and nDNA identifications may have other explanations, such as Incomplete Lineage Sorting. Some individuals collected in localities of Espírito Santo State, Brazil, presented a mix of morphological characters of T. mesophaeus and T. nigromaculatus, which are the only Trachycephalus species known to the region. However, previous studies using COI sequences grouped theses individuals as T. typhonius. Giving this, we sequenced fragments of two mitochondrial genes (COI and ND2) and part of the nuclear exon of tyrosinase of 173 individuals of Trachycephalus, in order to better clarify the taxonomic uncertainty, and the link between morphological and genetic characters behind the identifications, according to the occurrence area. Results of molecular phylogenies, genetic divergences, haplotype networks, and single nucleotide polymorphisms (SNPs) confirmed .T. mesophaeus, T. nigromaculatus, and T. typhonius as distinct evolutionary lineages and revealed seven more individuals potentially hybrids, but morphologically assigned to one species. Due to the slow mutation rate of tyrosinase, the most recently diverged species (T. typhonius and T. nigromaculatus) have not completely sorted in this gene. Trachycephalus mesophaeus is the oldest species of the three, and it was identified unambiguously in all analysis. Here, for the first time, evidence of bidirectional introgression between T. nigromaculatus and T. typhonius and between T. nigromaculatus and T. mesophaeus, with signs of F1 individuals, is presented. The use of ND2 gene seems to be more efficient than COI to recover the phylogenies in this particular group and, although tyrosinase is a slow evolving gene, it contributed significantly in order to identify cytonuclear incongruences. Our results indicate a complex phylogenetic history of Trachycephalus, and that more introgressive hybrids may be identified with the use of faster nuclear markers and the inclusion of more species of the genus in the analyses.. Keywords: Hybridization, polymorphism, molecular markers, amphibian. 1 INTRODUÇÃO Diversos estudos têm desmistificado a perspectiva tradicional de que a hibridização interespecífica é um fenômeno raro entre animais, oferecendo evidências de que táxons de diferentes grupos comumente compartilham uma história de hibridização introgressiva (Avise 1994; Mallet 2005; 2008). No entanto, identificar árvores filogenéticas conflitantes de DNA mitocondrial e DNA nuclear pode ter outros significados evolutivos, tal como o sorteamento incompleto de polimorfismos ancestrais (Incomplete Lineage Sorting – ILS). Adicionalmente, distinguir entre esses eventos é uma tarefa complexa, ainda mais se esses eventos ocorreram recentemente (Parham et al. 2013). Em anuros, o relato de cruzamentos interespecíficos gerando híbridos naturais vem sendo cada vez mais frequente em áreas de simpatria ou parapatria de espécies congenéricas como por exemplo Hyla, Phyllomedusa, Rhinella, Lithobates e Oophaga, Dyscophus (Lamb e Avise 1986; 1987; Haddad et al. 1990; Haddad et al. 1994; Azevedo et al. 2003; Austin et al. 2011; Sequeira et al. 2011; Thomé et al. 2012; Medina et al. 2013; Orozco-Terwengel 2013) A visão sobre híbridos está diretamente associada a indivíduos com características morfológicas intermediárias entre as espécies parentais (Hubbs 1955). A morfologia intermediária é um forte indício de hibridização, porém essa característica não deve ser considerada isoladamente, pois, caso os híbridos sejam férteis, há a possibilidade de indivíduos híbridos retrocruzarem com as espécies parentais e estarem “camuflados” nessas populações sob a morfologia preponderante de uma das espécies. Outro extremo é quando um indivíduo é aparentemente intermediário morfologicamente mas, na realidade, apresenta traços fenéticos raramente observados em uma espécie (Garofalo et al. 2012). Lamb e Avise (1987) conduziram um estudo que demonstrou que a morfologia intermediária em híbridos naturais pode levar a identificações errôneas se for utilizada como critério único. Nesse trabalho foram avaliados dados morfológicos (medidas osteológicas) e moleculares (marcadores mitocondriais e nucleares) das espécies parentais de pererecas Hyla gratiosa e H. cinerea e identificados os caracteres espécie- 2 específicos que as distinguem, definindo algumas medidas osteológicas de cada espécie que não mostravam sobreposição. Os autores verificaram com esse estudo que, caso somente a morfologia tivesse sido usada como referência, mais de 40% dos indivíduos híbridos confirmados via análise molecular teriam sido erroneamente identificados como espécies parentais “puras” e que cerca de 25% dos híbridos de retrocruzamentos não teriam sido discriminados de indivíduos F1. Esses resultados exemplificam a importância do uso conjunto de análises morfológicas e genéticas em estudos de hibridização e mostram as limitações inerentes de descrever casos de híbridos baseados somente em critérios morfológicos. Não obstante a morfologia represente um critério importante na descrição da diversidade em anuros, desde a década de 1970 tem-se observado uma maior integração da taxonomia alfa com outros tipos de dados, como a vocalização, citogenética e sequências de DNA. Juntamente com a morfologia, a vocalização é um importante atributo para a identificação de espécies de anuros, podendo atuar fortemente como uma barreira reprodutiva pré-zigótica (Lodé e Pagano 2000; Ângulo e Reichle 2008; Funk et al. 2011). Por outro lado, o canto de anúncio de uma espécie é considerado um caráter evolutivo conservado e táxons aparentados frequentemente apresentam vocalizações similares (Pough et al. 2003), o que poderia levar a uma falha no “sistema de reconhecimento de parceiro específico” (Paterson 1993), favorecendo a ocorrência de hibridação entre espécies proximamente relacionadas. Outra abordagem utilizada de forma complementar na identificação de espécies de anuros é a citogenética, podendo auxiliar na caracterização de híbridos ou de espécies crípticas (Haddad et al. 1994; Azevedo et al. 2003; Diaz et al. 2012; Gruber et al. 2013). No entanto, de forma geral, os anuros apresentam um padrão cariotípico bastante conservado, sendo que muitas vezes não são encontradas assinaturas citogenéticas que evidenciem a hibridização natural (Suarez 2010; Catroli 2011). Um exemplo dessa situação foi relatado por Azevedo e colaboradores (2003) que, ao se depararem com indivíduos de morfologia intermediária entre Rhinella schneideri e Rhinella icterica, tentaram identificar indícios de um cariótipo intermediário. Porém, nenhuma das análises citogenéticas foram informativas, sendo que o tipo intermediário somente pôde ser identificado por eletroforese de proteínas séricas. 3 A fim de tentar contornar todas as dificuldades inerentes à identificação baseada em caracteres morfológicos, foi proposta uma forma de identificação taxonômica, pela qual seriam encontradas combinações únicas em determinado gene para cada organismo que serviria como um código de barras de DNA, permitindo assim uma identificação taxonômica segura (Hebert 2003; 2010). O gene proposto para servir de código de barras universal foi o citocromo c oxidase subunidade 1 (COI) e, dentre os benefícios dessa abordagem são destacados: (i) permitir a identificação de espécies, seja em qualquer estágio de vida ou fragmento, (ii) facilitar a descoberta de espécies baseadas em análises de clados, (iii) promover o desenvolvimento tecnologia portátil para sequenciamento de DNA em campo, em inventários de biodiversidade e (iv) permitir percepções sobre a diversidade da vida (Savolainen et al. 2005). Essa abordagem inovadora têm sido eficiente na identificação da grande maioria (95%) das espécies examinadas (Mitchell 2008). No entanto, alguns estudos de simulação têm sugerido que o código de barras de DNA pode falhar na descoberta de novas espécies, especialmente aquelas que divergiram recentemente (Mitchell 2008). Uma alternativa encontrada é a utilização complementar de outros genes que apresentam taxa de evolução mais rápida que o COI, e que consigam recuperar linhagens mais recentes do DNA mitocondrial das espécies (Che et al. 2012). Cada vez mais as sequências de DNA têm sido utilizadas em estudos da anurofauna, em conjunto com informações morfológicas, bioacústicas, citogenéticas e biogeográficas (Fouquet et al. 2007; Vieites et al. 2009; Vieira 2010, Funk et al. 2011; Jansen et al. 2011; Kieswetter e Schneider 2013; Oliver et al. 2013). A junção dessas informações tem indicado uma grande quantidade de espécies crípticas, que são múltiplas espécies morfologicamente indistinguíveis, “escondidas” sob um único binômio taxonômico (Bickford et al. 2007). Nesse contexto, destacamos o gênero de anuro Trachycephalus Tschudi, 1838, em que há registros de possíveis indivíduos híbridos entre T. mesophaeus (Hensel, 1867) e T. nigromaculatus Tshudi, 1823 no município de Santa Teresa (Ramos e Gasparini 2004) e município de Serra, Espírito Santo (Tonini et al. 2011), pelo fato de alguns exemplares apresentarem morfologia intermediária ou com características de ambas as espécies. Esses indívíduos foram considerados ambíguos, uma vez que não se podia atribuir a identidade morfológica de uma única espécie. Assim, considerando que 4 T. mesophaeus e T. nigromaculatus são as únicas espécies do gênero de ocorrência conhecida para o Espírito Santo, foi levantada a possibilidade de que esses indivíduos sejam híbridos entre essas duas espécies. Contudo, estudos pilotos com sequências do gene Citocromo c Oxidase I (COI), indicaram que os indivíduos do município da Serra, Espírito Santo, de morfologia considerada intermediária entre T. mesophaeus e T. nigromaculatus, apresentam DNA mitocondrial de T. typhonius (Linnaeus, 1758) (Mattedi et al. 2010), uma espécie de ampla distribuição mas sem ocorrência registrada para o Espírito Santo (Haddad et al. 2013) (Figura 1). Dessa forma, como os resultados do estudo anterior não permitiram identificar os indivíduos com base na sequência de DNA, mostraram-se necessários estudos mais detalhados para a identificação de características genéticas das três espécies de Trachycephalus, assim como dos indivíduos morfologicamente ambíguos, utilizando não só marcadores mitocondriais, mas também nucleares. 5 Figura 1. Exemplares típicos de T. mesophaeus, T. nigromaculatus e T. typhonius e distribuição geográfica de cada espécie, hachurado em cinza, sendo os pontos marcados no mapa as localidades amostradas (Haddad et al. 2013). T. mesophaeus T. nigromaculatus T. typhonius 6 II. OBJETIVOS E METAS II.1. Objetivo Geral Avaliar características genética das espécies T. mesophaeus, T. nigromaculatus e T. typhonius e verificar a ocorrência de hibridização interespecífica. II.2. Metas a) Identificar características genéticas de cada espécie de Trachycephalus: i. identificar polimorfismos únicos (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) de dois genes mitocondriais e um gene nuclear das espécies T. mesophaeus, T. nigromaculatus e T. typhonius; ii. estimar os valores de divergência intra e interespecíficos; iii. inferir redes de haplótipos das espécies; iv. inferir as relações filogenéticas entre as três espécies de Trachycephalus; b) Verificar a ocorrência de híbridos interespecíficos i. identificar e descrever a ocorrência de hibridização introgressiva ou retenção de polimorfismo ancestral entre T. mesophaeus, T. nigromaculatus e T. typhonius; 7 III. MATERIAL E MÉTODOS III.1. Amostra A amostra consiste de 173 indivíduos de 66 localidades, todos previamente identificados por meio da morfologia externa pelos coletores. Destes, 76 exemplares são de T. mesophaeus de 32 localidades: 38 de T. nigromaculatus de 17 localidades e 55 de T. typhonius de 22 localidades (Figura 1, Tabela 1, Apêndice 1). Quatro indivíduos não foram classificados em uma das três espécies, mas considerados como potenciais híbridos por apresentarem morfologia intermediária. Assim, para o presente estudo, esses quatro indivíduos foram classificados como Trachycephalus sp (Tabela 1, Apêndice I, Figura 2). As amostras de tecidos foram obtidas por doação de pesquisadores de coleções de referência ou são provenientes de coletas realizadas no Espírito Santo e que fazem parte da Coleção de Tecidos e DNA da UFES (Apêndice I). Para os estudos de identificação molecular e definição de código de barras de DNA por espécie somente foram utilizados os indivíduos cujas identificações por especialistas no grupo foram substanciadas, com base em dados morfológicos sem problemas de identificação. Para os estudos de verificação de hibridação interespecífica foram analisados os quatro indivíduos de Trachycephalus sp. e outros exemplares que mostraram inconsistência entre a identificação morfológica e a identificação molecular. Nesse último caso, todos os exemplares foram reanalisados sob o ponto de vista morfológico pelo coletor, para confirmar a classificação original. Nos estudos filogenéticos foram utilizados cinco indivíduos de duas espécies da tribo Lophiohylini como grupos externos: Aparasphenodon brunoi Miranda-Ribeiro, 1920 e Osteocephalus taurinus Steindachner, 1862 (Apêndice I). http://research.amnh.org/vz/herpetology/amphibia/?action=names&a_id=2494 http://research.amnh.org/vz/herpetology/amphibia/?action=names&year=1862 8 Figura 2. Vista lateral (indivíduo JFT 473) e dorsal (indivíduo LGA3924) de potenciais híbridos deTrachycephalus. III.2. Extração, amplificação e sequenciamento de DNA O DNA total foi obtido de amostras de tecido muscular ou hepático, seguindo o protocolo descrito por Bruford et al. (1992), com modificações. A quantidade de DNA foi calculada em espectrofotômetro Nanodrop ND1000 (Thermo Scientific) e a qualidade foi avaliada em gel de agarose 1%. Os estudos foram baseados na análise de sequência de fragmentos de DNA referentes ao exon 1 do gene nuclear da Tirosinase (TYR, 515 pb) e aos genes mitocondriais Nicotinamida Desidrogenase subunidade 2 (ND2, 825 pb) e Citocromo 9 oxidase subunidade 1 (COI, 640 pb), obtidos por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A reação seguiu os perfis específicos conforme Tabela 2 utilizando a concentração de DNA de 50 ng/ml por reação. Tabela 1. Número de localidades por estado (nL) e de indivíduos (n) de cada espécie de Trachycephalus analisadas no presente estudo. Estado T. mesophaeus T. nigromaculatus T. typhonius Trachycephalus sp. Total nL n nL n nL n nL n n PI 1 5 5 PA 3 3 3 RO 1 4 4 AM 1 3 3 MA 1 1 1 GO 1 2 2 MS 1 2 2 MT 2 9 9 TO 7 17 17 BA 8 28 3 6 34 ES 4 21 7 17 1 4 42 MG 1 1 4 12 1 2 15 RJ 5 6 2 2 8 SP 10 16 1 1 3 7 24 SC 3 3 3 RS 1 1 1 Sub- total 32 76 17 38 22 55 1 4 173 10 Tabela 2. Concentrações e quantidades dos reagentes e primers utilizados nas reações de PCR de cada gene e perfis das PCRs. Marcador ND2 COI TYR Master Mix [ ] dNTP 10 mM 10 mM 10 mM Tampão 10x 10x 10x MgCl2 50 mM 50 mM 50 mM Primers 10 mM 10 mM 10 mM Platinum® Taq 1 unidade 1 unidade 1 unidade’’ Volume total 25 µl 25 µl 25 µl Perfil (temperatura e tempo) Denaturação inicial 94ºC, 5’ 94ºC, 5’ 94ºC, 30’’ Nº de ciclos 10 + 25 35 35 Denaturação 94ºC, 30’’ 94ºC, 30’’ 94ºC, 30’’ Anelamento 60ºC, 30’’+ 58ºC, 30’’ 47ºC-45’’ 58ºC, 30’’ Extensão 72ºC – 45’’ 72ºC-45’’ 72ºC-1’ Extensão final 72ºC – 10’ 72ºC-5’ 72ºC-6’ Primer forward ND2ELEUF LCO1490 TYR1C Primer reverse ND2ALAR HCO2198 TYR1G Referência Carnaval e Bates 2007 Folmer et al. 1994 Bossuyt e Milinkovitch 2000 Todas as reações de PCR foram realizadas em um termociclador ABI Veriti® 3500 (Applied Byostems, EUA). O sucesso da amplificação foi verificado utilizando-se 2μl do produto de PCR e 2μl de BlueJuice ® (Invitrogen, EUA) submetidos a uma eletroforese em gel de agarose 2% a 100V por 45 minutos. Foi utilizado o corante intercalante de DNA GelRed ® (Biotium, EUA) e visualizado sob incidência de luz ultravioleta em um Sistema de Fotodocumentação L-Pix Touch® (Loccus, Brasil). Todas as PCR foram feitas utilizando-se água Milli-Q ® (MilliPore Corporation, EUA) como controle negativo em sala isolada (pré-PCR) e as misturas de PCR foram preparadas em uma capela previamente esterilizada com hipoclorito de sódio 10% e álcool 70%, onde nenhum DNA é manipulado. Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit de purificação ExoSAP-IT® (USB Corporation, EUA) seguindo-se o protocolo do fabricante. Esse método de purificação utiliza duas enzimas hidrolíticas, Exonuclease I e Shrimp Alkaline fosfatase, que degradam restos de primers e dNTPs em uma solução tampão, adicionando-se 1 µl da solução do kit diluídos 1:4 para cada 10 µl do produto de PCR. 11 Geralmente, foi gerada a sequência de DNA a partir da fita senso, utilizando-se o primer forward. Porém, quando necessário, a fita antissenso foi utilizada para confirmar ambiguidades. As reações de sequenciamento e precipitação foram realizadas em sequenciador ABI3500 (Applied Biosystems, EUA) do Núcleo de Genética Aplicada à Conservação da Biodiversidade (NGACB) da Universidade Federal do Espírito Santo. III.3. Análise dos dados A identidade das sequências foi confirmada pelo método BLAST (Altschul 1997), que compara as sequências geradas com as disponíveis no GenBank® (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). As sequências foram alinhadas no programa MEGA 5.2 (Tamura et al. 2011) com auxílio da opção ClustalX (Thompson et al. 1994) e conferidas visualmente. Para todos os genes utilizou-se a estrutura primária da proteína como referencial para o alinhamento. III.3.1. Avaliação da identidade molecular das espécies e dos indivíduos Para a caracterização molecular de uma espécie e de cada indivíduo do presente estudo foram seguidas as seguintes abordagens, nessa ordem: a) a definição de haplótipos que se agrupavam como um grupo monofilético; b) cálculo da divergência genética entre os haplótipos, mostrando baixa divergência dentro e alta divergência entre as espécies; c) definição da relação hierárquica entre os haplótipos em uma rede de haplótipos; d) identificação de polimorfismos únicos espécie-específicos (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs). As hipóteses filogenéticas baseadas em critérios de Máxima Verossimilhança (MV) foram obtidas na plataforma online PhyML 3.0 (Guindon et al. 2010) e, pela Inferência Bayesiana (IB), no programa MrBayes 3.1 (Ronquist et al. 2012), seguindo o padrão de configuração proposto pelo modelo com 2 milhões de gerações iniciais http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 12 com amostragens a cada 100 e 25% de burn-in, mais 1 milhão de gerações adicionadas sempre que o desvio padrão médio final era superior a 0,01. Os modelos de substituição nucleotídica apropriados para os critérios de MV e IB, foram determinados a partir o programa jModelTest 2.1.3 (Darriba et al. 2012), com aplicação do critério de correção de Akaike para a análise de Máxima Verossimilhança e de BIC para a análise de Inferência Bayesiana. Foram considerados clados confiáveis aqueles que apresentaram valores de bootstrap acima de 75% (MV) e de probabilidades posteriores acima de 95% (IB). Para recuperar as relações filogenéticas entre as três espécies foram utilizadas todas as sequências dos indivíduos sem dúvidas quanto à identificação. As distâncias genética intra e interespecíficas foram estimadas no programa MEGA 5.2 (Tamura et al. 2011) para cada uma das espécies. Na matriz de distância foram utilizados somente os exemplares sem dúvidas na identificação morfológica para definirem-se os padrões de divergência entre as três espécies-alvo. O modelo de substituição nucleotídica foi o Kimura 2 parâmetros, em que as taxas de transição e as taxas de transversão são consideradas separadamente, e foram realizadas 1000 replicações como bootstrap. Os haplótipos foram identificados no programa DnaSP v.5 (Librado e Rozas 2009) e as redes de haplótipos geradas no programa NETWORK 4.1 (Rohl 2000 www.fluxus-engineering.com). Nesse programa as redes de haplótipos são geradas com base na implementação do algoritmo median–joining, que gera uma árvore (minimum spanning tree) e adiciona os intermediários ausentes usando o algoritmo de máxima parcimônia de Farris (Bandelt et al. 1999). Como a tirosinase é um gene nuclear, fez-se necessário usar a ferramenta “Unphase” do programa para separar as fases dos indivíduos com alelos heterozigotos (Figura 3). Essa ferramenta utiliza o algoritmo fornecido pelo PHASE (Stephens et al. 2001; Stephens e Donelly 2003) que é baseado em um método de coalescência bayesiano para inferir os haplótipos. Devido a essa etapa, cada sequência de uma amostra correspondeu a dois haplótipos na rede. Os polimorfismos de nucleotídeos únicos (Single Nucleotide Polymorphisms – SNPs) de cada gene foram verificados visualmente e foram considerados loci diagnósticos aqueles que se mostraram distintos em comparação a uma ou duas espécies. A numeração dos SNPs teve início a partir do final da sequência de cada primer. http://www.fluxus-engineering.com/ 13 Figura 3. Pico duplo em eletroferograma do gene tirosinase indicando heterozigose na posição 144 (quadrado). Y=C+T segundo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry). III.3.2. Verificação da ocorrência de híbridos interespecíficos Os exemplares alvo da verificação de ocorrência de hibridação interespecífica foram os quatro indivíduos previamente identificados como Trachycephalus sp. do município da Serra, Espírito Santo. Outros sete indivíduos apresentaram identificação morfológica determinada pelo coletor, porém apresentaram discrepâncias sobre a identidade molecular dos genes mitocondriais e nuclear. Assim, por serem suspeitos de serem híbridos, foram tratados em conjunto com os indivíduos da Serra, ES, sendo eles CFBH9156 de Jequié (BA), MTR22113 de Wenceslau Guimarães (BA), MTR12040 de Linhares (ES, MTR2815 de Baixa Grande do Ribeiro (PI), MTR5003 da Chapada dos Guimarães (MT) e MTR509 e MTR510 de Januária (MG). Todos os indivíduos que apresentaram nos estudos filogenéticos a identificação molecular com um gene mitocondrial de uma espécie e com o gene nuclear de outra espécie foram selecionados como potenciais híbridos, e todos foram sequenciados novamente antes de seguiram para a análise da divergência genética. Foi confirmado como potencial híbrido o exemplar que apresentou valores de divergência molecular e SNPs que confirmassem a incongruência citonuclear. A partir do conjunto de resultados foram analisados os possíveis híbridos, caso a caso, visando distinguir um padrão de compartilhamento de polimorfismos, que poderiam ser resultado de hibridação interespecífica ou retenção de polimorfismos ancestrais (Incomplete Lineage Sorting – ILS). 14 15 IV. RESULTADOS IV.1. Identidade molecular das espécies A quantidade de sequências geradas de cada espécie por gene estão sumarizados na Tabela 3. Tabela 3. Relação do número de sequências geradas por espécie nos genes mitocondriais COI e ND2 e no gene nuclear Tirosinase. Espécie Número de sequências geradas COI (645pb) ND2 (825pb) Tirosinase (515pb) Total T. mesophaeus (n=76) 61 56 57 174 T. nigromaculatus (n=38) 34 36 35 105 T. typhonius (n=55) 31 41 48 120 Sub-total 126 133 140 399 O modelo evolutivo utilizado para a análise de Máxima Verossimilhança do gene COI foi GTR+I+G, sendo a proporção de sítios invariáveis = 0,5420 e a distribuição gama = 1,4550 e o modelo usado na Inferência Bayesiana foi o HKY+G, sendo gama=0,2380. O modelo evolutivo utilizado para a análise de Máxima Verossimilhança no gene ND2 foi o GTR+I+G, sendo inv=0,3540 e gama=1,0190 e o modelo usado na Inferência Bayesiana foi o HKY+I+G, sendo inv=0,2950 e gama=0,7510. O modelo evolutivo utilizado para a análise de MV e IB no gene tirosinase foi o GTR+I+G, sendo inv=0,6660 e gama=0,8090. As topologias das árvores dos genes mitocondriais não foram similares. A árvore do ND2 corrobora o monofiletismo das três espécies, apesar de haplótipos divergentes de T. typhonius (denominado Clado Marajó). No gene COI T. mesophaeus não foi recuperado como monofilético (Figura 4). Diferentemente, no gene nuclear a única espécie que apresentou alto suporte foi T. mesophaeus, apesar de T. nigromaculatus e T. typhonius formarem agrupamentos distintos entre si (Figura 4). Na análise dos genes concatenados observou-se a formação de três clados com alto suporte (MV>75 e IB >95) correspondente as espécies analisadas (Figura 5). 16 Ao analisar as filogenias, além dos quatro indivíduos de Trachycephalus sp., foram observados sete indivíduos com discrepâncias citonucleares (DNAmt de uma espécie e DNAn de outra espécie) (Figura 7). Esses indivíduos foram retirados das análises posteriores de caracterização das espécies e analisados em conjunto com os indivíduos de Trachycephalus sp. ND2 COI 17 Figura 4. Árvores filogenéticas dos genes ND2, COI e TYR. Valores acima dos ramos correspondem ao suporte da ML e probabilidades posteriores da IB, respectivamente. Figura 5. Árvores filogenéticas dos genes concatenados ND2, COI e Tirosinase. Valores acima dos ramos correspondem ao suporte da ML e probabilidades posteriores da IB, respectivamente. TYR 18 A distância genética intraespecífica no gene ND2 (Tabela 4) variou de 2,1-2,5%, do gene COI variou de 1,1-2,2% e do gene tirosinase mostrou baixa variação intraespecífica de 0,6-0,8%. A divergência interespecífica do gene ND2 variou de 12,5- 13,9%, do gene COI de 13,1-16,6% e do TYR variou de 1,6 a 3,2%. Os valores de divergência genética interespecífica foram, no mínimo, seis vezes maiores que as distâncias intraespecíficas no ND2 e quase três vezes no COI. Nas sequências da tirosinase as distâncias interespecíficas são 2,5 vezes superiores às distâncias intraespecíficas. Tabela 4. Distâncias genéticas intraespecíficas (diagonal) e interespecíficas (cinza) para os genes ND2, COI e Tirosinase das espécies T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni). Espécie 1 2 3 ND2 1.Tty 0,024 2.Tme 0,129 0,025 3.Tni 0,139 0,125 0,021 COI 1.Tty 0,011 2.Tme 0,131 0,017 3.Tni 0,166 0,152 0,022 Tirosinase 1.Tty 0,006 2.Tme 0,028 0,007 3.Tni 0,016 0,032 0,008 Foram observados 83 polimorfismos únicos (SNPs) nos três genes analisados (Tabelas 5 a 8). Somente os genes mitocondriais apresentaram juntos 75 SNPs (90,36%). O gene COI apresentou maior frequência de SNPs em relação ao total do tamanho do fragmento do gene (640 pb), com 7,13% de suas bases nitrogenadas correspondendo a polimorfismos únicos, enquanto que no ND2 essa proporção foi de 3,75% (825 pb) e no TYR apenas 1,55% (515pb). 19 Ao analisar os SNPs diagnosticos foram identificadas posições em que um determinado nucleotídeo em uma espécie era distinto em relação às outras duas (i.e. na posição 105 do gene ND2, ocorre Citosina somente em T. typhonius enquanto nas duas outras espécies o nucleotídeo era Timina). Assim, após essa análise, foram detectados 19 SNPs exclusivos a T. typhonius, 25 para T. mesophaeus e 30 para T. nigromaculatus (Tabela 5). Foram observados SNPs exclusivos que diferenciam cada espécie apenas nos genes mitocondriais (Tabelas 6 e 7). Foram identificadas quatro posições no ND2 (465, 552, 585 e 798) e cinco no gene COI (177, 210, 270, 300 e 522) (Tabelas 5 e 6). Na tirosinase não ocorrem SNPs exclusivos para cada espécie, sendo que duas posições permitem a distinção entre T. nigromaculatus e T. typhonius (99 e 235) e seis posições diferem T. mesophaeus das duas espécies (102, 171, 180, 236, 242 e 264) (Tabela 7). Tabela 5. Polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) para os genes ND2, COI e TYR eL de T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni) e que são diferentes entre as três. Espécies Tty Tme Tni Tty x Tme x Tni n ND2 8 11 7 4 30 COI 11 8 21 5 45 TYR 0 6 2 0 8 Total SNPs 19 25 30 9 83 Tabela 6. Polimorfismos de nucleotídeos únicos que caracterizam as espécies T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni) no gene ND2. Em cinza as posições contendo SNPs espécie-específicos. 018 069 105 141 153 169 219 249 250 252 255 357 462 465 468 Tty T C C A A T C C C A T C C G T Tme C T T G A C T T T G T C T T C Tni T C T A T C C C T A C T C C C 504 534 552 561 580 585 594 610 625 642 657 679 711 798 805 Tty T A A T A A A A G A T C T T G Tme C T T C A T A G A G T T C A G Tni T A C C T C G G A A C T T G A 20 Tabela 7. Polimorfismos de nucleotídeos únicos que caracterizam as espécies T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni) no gene COI. 066 069 075 087 090 093 114 132 147 169 171 174 177 201 210 Tty G G C T C T T G A C A G G A A Tm eee G A C T T T T A A C A C A G C Tni T A T C T A C A G T G C C G T 231 234 243 262 270 300 318 324 330 333 342 357 372 393 396 Tty T A C C C T T C C C C T C T C Tm e C A C T T C C T T T C T C T T Tni C G A C A A T T C T T C T C T 414 435 456 474 477 504 520 522 549 555 564 567 568 597 624 Tty T C C A C T C C A A C T C G C Tm e T T T A T C C T G A C C C G T Tni C C C G C T T A G G T T T A T Tabela 8. Polimorfismos de nucleotídeos únicos que caracterizam as espécies T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni) no gene TYR. 99 102 171 180 235 236 242 264 Tty C T G G A C A C Tme C C A A A A T T Tni T T G G C C A C As redes de haplótipos de todos os genes analisados apresentaram basicamente a mesma conformação, com três agrupamentos estruturados correspondentes a cada espécie e não foi identificado compartilhamento de haplótipos entre as espécies (Figura 6, Apêndices I e II). O haplogrupo de T. mesophaeus sempre se posicionou intermediário a T. nigromaculatus e T. typhonius nos genes mitocondriais, enquanto que na tirosinase a espécie intermediária foi T. typhonius. Dentre as 128 sequências de COI foram observados 59 haplótipos com alta diversidade haplotípica total (h= 0,96), 188 sítios polimórficos e diversidade nucleotídica π= 0,09085. Os haplogrupos representativos das espécies ficaram separados por 46 a 61 passos mutacionais. Em T. typhonius (n=31) foram observados 21 22 haplótipos (C1-C22), em T. mesophaeus (n=61) observaram-se 22 haplótipos (C23- C44) e em T. nigromaculatus (n=36) observaram-se 15 haplótipos (C45-C59). No ND2 foram sequenciados 135 indivíduos que se agruparam em 68 haplótipos, com alta diversidade haplotípica total (h= 0,98), 286 sítios polimórficos e diversidade nucleotídica π= 0,09497. Os haplogrupos representativos das espécies ficaram separados por 36 passos mutacionais. Em T. typhonius (n=41) foram observados 18 haplótipos (N1-N18), em T. mesophaeus (n=57) observaram-se 32 haplótipos (N19-N52) e em T. nigromaculatus (n=37) observaram-se 14 haplótipos (N53-N68). Na rede de haplótipos da tirosinase os haplogrupos das espécies ficaram separados por 2 a 8 passos mutacionais. Das 284 sequências da tirosinase (dois alelos por indivíduo) de 142 indivíduos de Trachycephalus foram observados 135 haplótipos e 75 sítios polimórficos. A diversidade haplotípica foi alta e variou entre as espécies de 0,95 a 0,98. Por outro lado, a diversidade nucleotídica foi baixa, variando entre 0,00752 a 0,00988. Para T. typhonius, das 96 sequências de 48 indivíduos de foram obtidos 37 haplótipos, sendo 25 indivíduos homozigotos (52,08%) e 23 indivíduos heterozigotos (47,91%). Para T. mesophaeus, das 116 sequências de 57 indivíduos foram obtidos 54 haplótipos, sendo 22 indivíduos homozigotos (38,59%) e 35 heterozigotos (61,40%). Das 72 sequências de 35 indivíduos de T. nigromaculatus foram obtidos 41 haplótipos, sendo 11 indivíduos homozigotos (31,4%) e 24 heterozigotos (68,57%). 22 Figura 6. Rede de haplótipos dos genes COI, ND2 e Tirosinase. A frequência dos haplótipos é proporcional ao tamanho dos círculos. Círculos pretos representam haplótipos intermediários gerados pelo programa. O tamanho das linhas é proporcional ao número de passos mutacionais (até 5 passos). Números acima das barras representam o número de passos mutacionais (exceto na tirosinase) e corresponde, em sua maioria, a um único passo mutacional. COI TYR ND2 23 IV.2. Potenciais híbridos interespecíficos A identificação da origem do genoma materno dos onze indivíduos potencialmente híbridos foi verificada pelo posicionamento dos haplótipos dos genes COI e ND2 em árvores filogenéticas. A identificação foi congruente entre os dois genes (Figura 6), revelando o genoma materno de T. nigromaculatus para cinco indivíduos de localidades no Espírito Santo (MTR12040), Bahia (CFBH9156), Piauí (MTR2815) e Minas Gerais (MTR509 e MTR510); cinco de T. typhonius do Mato Grosso (MTR5003) e do Espírito Santo (JFT473, JFT757, JFT955 e LGA3924) e um da Bahia de T. mesophaeus (MTR22113) (Apêndice I, Tabela 9, Figura 12) A identificação do genoma nuclear (Figura 7) mostrou cinco indivíduos homozigotos quanto ao haplótipo e seis indivíduos heterozigotos, com haplótipos distintos. Os cinco indivíduos homozigotos apresentaram o mesmo haplótipo para o genoma de origem materna quanto paterna, representando uma única espécie, sendo que JFT473, JFT757, JFT955 e LGA3924 associaram-se a T. nigromaculatus e CHBH9156 à T. mesophaeus. Dos seis indivíduos heterozigotos, embora com haplótipos distintos, quatro indivíduos apresentaram origem do genoma e materno e paterno associada à mesma espécie, enquanto que dois indivíduos mostraram que o genoma materno era distinto do genoma paterno. O indivíduo MTR12040 de Linhares, norte do Espírito Santo apresentou dois haplótipos distintos, mas os dois associados à T. mesophaeus. Igualmente, os indivíduos de MTR509 e MTR510 de Januária, Minas Gerais, mostraram alelos distintos, mas ambos associados a T. typhonius. Da mesma forma, o indivíduo MTR22113 de Wenceslau Guimarães, Bahia apresentou haplótipos distintos, mas ambos associados à T. nigromaculatus. Os indivíduos do Piauí (MTR2815, de Baixa Grande do Ribeiro) e Mato Grosso (MTR5003, de Chapada dos Guimarães) mostraram um haplótipo associado à T. typhonius e outro à T. nigromaculatus (Figura 7). A distância genética dos indivíduos híbridos baseada nos respectivos genes mitocondriais mostrou valores que correspondem à variação intraespecífica, dando suporte para a identificação dos genomas maternos (Tabela 8). Para o gene tirosinase, 24 dada a baixa diferenciação genética entre os haplótipos específicos de T. typhonius e T. nigromaculatus, não foi possível confirmar a origem dos genomas maternos e paternos somente por essa ferramenta. Para os genomas associados à T. mesophaeus não houve dificuldade em confirmar a identidade do genoma nuclear pela divergência genética. As redes de haplótipos geradas para cada gene, incluindo os 11 indivíduos possivelmente híbridos, revelaram que os haplótipos de cada espécie se organizaram em agrupamentos distintos e confirmaram a origem dos genomas materno e paternos já identificados pelas árvores filogenéticas e pela distância genética (Figura 8). Novamente os indivíduos heterozigotos do Piauí e Mato Grosso ficaram agrupados com dois haplogrupos distintos, correspondentes a T. typhonius e T. nigromaculatus. A identificação de polimorfismos de nucleotídeos únicos mostrou SNPs diagnósticos e foi eficiente para identificar o genoma mitocondrial e nuclear de cada indivíduo (Tabela 11 e Figura 9). No entanto, o indivíduo da Chapada dos Guimarães (MTR5003) não seria identificado como híbrido somente os SNPS tivessem sido utilizados. Somente dois SNPs diferem T. nigromaculatus de T. typhonius e esse indivíduo é heterozigoto na posição 99, fazendo com que a posição 235 o caracterizasse como T. typhonius no gene nuclear (Tabela 10). A integração dos dados moleculares permitiu que fossem feitas extrapolações acerca da origem dos genomas materno e paterno de cada indivíduo potencialmente híbrido. Dessa forma, foram levantadas as possibilidades de os indivíduos parentais serem híbridos ou não: de esses serem heterozigotos ou homozigotos e se poderiam indicar geração F1 ou posterior. No entanto, a confirmação da origem de cada alelo só seria possível clonando-se o gene nuclear. O indivíduo da Bahia CFBH9156 (Figura 10a) apresentou genoma materno de T. nigromaculatus (Figuras 7, 9, 10 e Tabela 9) e genoma nuclear (materno+paterno) de T. mesophaeus (Figuras 9, 10, 11 e Tabela 9). O parental materno desse indivíduo era obrigatoriamente um híbrido (F1 ou posterior), pois necessariamente cedeu o haplótipo mitocondrial de T. nigromaculatus e um haplótipo nuclear T. mesophaeus. O parental paterno cedeu um haplótipo nuclear T. mesophaeus. Assim, pela nossa análise, o indivíduo CFBH9156 pode ser um potencial híbrido de geração F2, no mínimo. 25 Os indivíduos de Minas Gerais MTR509 e MTR510 (Figura 11b) apresentaram genoma materno de T. nigromaculatus (Figuras 7, 9, 10 e Tabela 9) e genoma nuclear (materno+paterno) de T. typhonius (Figuras 8, 9, 10 e Tabela 9). Os parentais maternos desses indivíduos eram obrigatoriamente híbridos (F1 ou posterior) e também heterozigotos, pois necessariamente cederam o haplótipo mitocondrial de T. nigromaculatus e um haplótipo nuclear T. typhonius. O parental paterno cedeu um haplótipo nuclear T. typhonius. Assim, pela nossa análise, os indivíduos MTR509 e MTR510 são potenciais híbridos de geração F2, no mínimo. O indivíduo do Piauí MTR2815 (Figura 11c) apresentou genoma materno de T. nigromaculatus (Figuras 7, 9, 10 e Tabela 10) e genoma nuclear (materno+paterno) de T. nigromaculatus e T. typhonius (Figuras 8, 9, 10 e Tabela 9). Com os presentes dados não há como determinar se o parental materno desse indivíduo era um híbrido, pois sabemos apenas que esse cedeu o haplótipo mitocondrial de T. nigromaculatus e um haplótipo nuclear T. nigromaculatus. O parental paterno cedeu um haplótipo nuclear T. typhonius. Assim, pela nossa análise, o indivíduo MTR2815 poderia ser um híbrido de geração F1, no mínimo. O indivíduo do Mato Grosso MTR5003 (Figura 11d) apresentou genoma materno de T. typhonius (Figuras 7, 9, 10 e Tabela 9) e genoma nuclear (materno+paterno) de T. nigromaculatus e T. typhonius (Figuras 8, 9, 10 e Tabela 9). Com os presentes dados não há como determinar se o parental materno desse indivíduo era um híbrido, pois sabemos apenas que esse cedeu o haplótipo mitocondrial de T. typhonius e um haplótipo nuclear T. typhonius. O parental paterno cedeu um haplótipo nuclear T. nigromaculatus. Assim, pela nossa análise, o indivíduo MTR5003 poderia ser um híbrido de geração F1, no mínimo. O indivíduo do Espírito Santo MTR12040 (Figura 11e) apresentou genoma materno de T. nigromaculatus (Figuras 7, 9, 10 e Tabela 9) e genoma nuclear (materno+paterno) de T. mesophaeus (Figuras 8, 9, 10 e Tabela 9). O parental materno desse indivíduo era obrigatoriamente um híbrido (F1 ou posterior), pois necessariamente cedeu o haplótipo mitocondrial de T. nigromaculatus e um haplótipo nuclear T. mesophaeus. O parental paterno cedeu um haplótipo nuclear T. mesophaeus. 26 Assim, pela nossa análise, o indivíduo MTR12040 seria um potencial híbrido de geração F2, no mínimo. O indivíduo da Bahia MTR22113 (Figura 11f) apresentou genoma materno de T. mesophaeus (Figuras 7, 9, 10 e Tabela 9) e genoma nuclear (materno+paterno) de T. mesophaeus (Figuras 8, 9, 10 e Tabela 9). O parental materno desse indivíduo era obrigatoriamente um híbrido (F1 ou posterior) e também heterozigoto, pois necessariamente cedeu o haplótipo mitocondrial de T. nigromaculatus e um haplótipo nuclear T. mesophaeus. O parental paterno cedeu um haplótipo nuclear T. mesophaeus. Assim, pela nossa análise, o indivíduo MTR22113 seria um potencial híbrido de geração F2, no mínimo. Os indivíduos do Espírito Santo JFT 473, JFT757, JFT955 e LGA3924 (Figura 11g) apresentaram genoma materno de T. typhonius (Figuras 7, 9, 10 e Tabela 10) e genoma nuclear (materno+paterno) de T. nigromaculatus (Figuras 8, 9, 10 e Tabela 11). Os parentais maternos desses indivíduos eram obrigatoriamente híbridos (F1 ou posterior) e também heterozigotos, pois necessariamente cederam o haplótipo mitocondrial de T. typhonius e um haplótipo nuclear T. nigromaculatus. O parental paterno cedeu um haplótipo nuclear T. nigromaculatus. Assim, pela nossa análise, os indivíduos JFT 473, JFT757, JFT955 e LGA3924 seriam potenciais híbridos de geração F2, no mínimo. 27 Figura 7. Árvores de haplótipos dos genes ND2 e COI com os indivíduos de morfologia intermediária e os demais exemplares que apresentaram incongruências citonucleares. Tty = T. typhonius, Tme= T.mesophaeus e Tni= T.nigromaculatus. ND2 COI 28 Figura 8. Árvore da tirosinase com destaque para o posicionamento dos alelos dos prováveis híbridos (indicado pelo número do haplótipo). Os espécimes que tiveram alelos agrupados com espécies diferentes estão destacados com um asterisco. Ver haplótipos no Apêndice II. TYR 29 Tabela 9. Conjunto de evidências dos potenciais indivíduos híbridos, incluindo a identificação morfológica de cada indivíduo, as identificações nos genes COI e ND2 (DNAmt) e na tirosinase (DNAn) nas análises filogenéticas, pelas distâncias interespecíficas e na comparação com os SNPs espécie-específicos. Identificação morfológica Filogenias Distâncias SNPs Amostra Localidade Estado DNAmt DNAn DNAmt DNAn DNAmt DNAn Heterozigoto LGA 3924 Serra ES N/C Tty Tni Tty Tty/Tni Tty Tni N JFT 473 Serra ES N/C Tty Tni Tty Tty/Tni Tty Tni N JFT 757 Serra ES N/C Tty Tni Tty Tty/Tni Tty Tni N JFT 955 Serra ES N/C Tty Tni Tty Tty/Tni Tty Tni N MTR 12040 Linhares ES Tme Tni Tme Tni Tme Tni Tme S MTR 22113 W. Guimarães BA Tme Tme Tni Tme Tty/Tni Tme Tni S CFBH 9156 Jequié BA Tme Tni Tme Tni Tme Tni Tme N MTR 2815 B.G.Ribeiro PI Tty Tni Tty e Tni Tni Tty/Tni Tni Tty S MTR 5003 C. Guimarães MT Tty Tty Tty e Tni Tty Tty/Tni Tty Tty/Tni S MTJ 509 Januária MG Tty Tni Tty Tni Tty/Tni Tni Tty S MTJ 510 Januária MG Tty Tni Tty Tni Tty/Tni Tni Tty S Tty= T. typhonius; Tme= T. mesophaeus e Tni= T. nigromaculatus; DNAmt = mitocondrial; DNAn = nuclear; N/C = não caracterizado; S = Sim e N = Não. 30 Tabela 10. Distância genética intraespecífica (cinza) e interespecífica (rosa) para os genes ND2, COI e Tirosinase das espécies T. typhonius (Tty), T. mesophaeus (Tme) e T. nigromaculatus (Tni). As distâncias genéticas entre os haplótipos observados dos potenciais híbridos em relação às espécies parentais são apresentadas em verde. Espécie/Indivíduos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ND2 1. T. mesophaeus 0,025 2. T. nigromaculatus 0,124 0,021 3. T. typhonius 0,125 0,135 0,024 4. ChapGui_Tty (n=1) 0,118 0,140 0,023 5. BGrande _Tty (n=1) 0,132 0,019 0,138 0,143 6. Januaria_Tty (n=2) 0,126 0,021 0,129 0,134 0,010 7. Jequie_Tme (n=1) 0,128 0,024 0,138 0,143 0,017 0,022 8. Linhares_Tme (n=1) 0,129 0,019 0,135 0,139 0,012 0,015 0,015 9. Serra_Tsp (n=4) 0,121 0,134 0,019 0,027 0,136 0,127 0,136 0,133 10. WGui_Tme (n=1) 0,028 0,134 0,120 0,107 0,140 0,134 0,140 0,137 0,115 COI 1. Tme 0,017 2. Tni 0,150 0,022 3. Tty 0,126 0,162 0,011 4. ChapGui_Tty (n=1) 0,123 0,163 0,006 5. BGrande _Tty (n=1) 0,149 0,021 0,169 0,169 6. Januaria_Tty (n=2) 0,144 0,019 0,168 0,169 0,008 7. Jequie_Tme (n=1) 0,153 0,023 0,168 0,168 0,027 0,025 8. Linhares_Tme (n=1) 0,152 0,019 0,163 0,164 0,023 0,019 0,017 9. Serra_Tsp (n=4) 0,128 0,163 0,009 0,004 0,169 0,169 0,168 0,164 Tirosinase 1. Tme 0,007 2. Tni 0,013 0,008 3. Tty 0,012 0,002 0,006 4. ChapGui_Tty (n=1) 0,012 0,001 0,000 5. BGrande _Tty (n=1) 0,012 0,001 0,000 0,000 6. Januaria_Tty (n=2) 0,012 0,001 0,000 0,000 0,000 7. Jequie_Tme (n=1) 0,001 0,012 0,011 0,011 0,011 0,011 8. Linhares_Tme (n=1) 0,001 0,012 0,011 0,011 0,011 0,011 0,000 9. Serra_Tsp (n=4) 0,018 0,008 0,006 0,006 0,006 0,006 0,017 0,017 10. WGui_Tme (n=1) 0,012 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000 0,011 0,011 0,006 31 COI ND2 TYR Figura 9. Rede de haplótipos dos genes COI, ND2 e Tirosinase com os indivíduos híbridos. Verde representa os haplogrupos de T. nigromaculatus (Tni), vermelho T. mesophaeus (Tme) e azul T. typhonius (Tty). Os haplótipos dos indivíduos híbridos estão indicados pelas cores na legenda, com distinção do DNA mitocondrial (DNAmt) e DNA nuclear (DNAn). 32 Tabela 11. Identificação dos potenciais híbridos por meio de SNPs espécie-específicos. Em vermelho T. mesophaeus =Tme, em verde T. nigromaculatus=Tni,em azul T. typhonius=Tty e em cinza alelos de T. typhonius e T. nigromaculatus Amostra Localidade Estado morfologia DNAmt DNAn MTR 22113 W. Guimarães BA Tme Tme Tni MTR 12040 Linhares ES Tme Tni Tme CFBH 9156 Jequié BA Tme Tni Tme MTR 2815 B.G.Ribeiro PI Tty Tni Tty /Tni MTJ 509 Januária MG Tty Tni Tty MTJ 510 Januária MG Tty Tni Tty MTR 5003 C. Guimarães MT Tty Tty Tty/Tni LGA 3924 Serra ES Tsp Tty Tni JFT 473 Serra ES Tsp Tty Tni JFT 757 Serra ES Tsp Tty Tni JFT 955 Serra ES Tsp Tty Tni Figura 10. Correspondência dos SNPs espécie-específicos de T. mesophaeus (vermelho), T. typhonius (azul) e T. nigromaculatus (verde) com os indivíduos híbridos em relação ao DNA mitocondrial e DNA nuclear. 33 Figura 11. Possíveis heredogramas dos indivíduos híbridos, representados pelos losangos. Os círculos representam o indivíduo materno e o retângulo o paterno. A primeira linha dentro de cada figura geométrica indica o DNAmt e a segunda linha indica o DNAn. As siglas indicam T. nigromaculatus (Tni), T. mesophaeus (Tme) e T. typhonius (Tty). F1 seria primeira geração e F2 seria segunda geração ou posterior. 34 Figura 12. Mapa com distribuições das espécies T. mesophaeus (área hachurada), T. nigromaculatus (área cinza escura) e T. typhonius (área cinza clara), com localidades dos possíveis híbridos (círculos). Destacados pelas setas estão os híbridos em que uma das possíveis espécies parentais não é conhecida para a localidade. No caso dos indivíduos de Baixa Grande do Ribeiro/ PI e Chapada dos Guimarães/MT não ocorre T. nigromaculatus e nos indivíduos da Serra/ES não há registros de T. typhonius para o Espírito Santo. O genoma dos indivíduos está representado pelas cores das respectivas espécies nos círculos, sendo o lado esquerdo correspondente ao DNAmt e o lado direito os alelos do DNAn. 35 V. DISCUSSÃO Identificando assinaturas genéticas para as espécies T. mesophaeus, T. nigromaculatus e T. typhonius As abordagens metodológicas utilizadas no presente estudo foram eficazes em identificar assinaturas genéticas das três espécies de Trachycephalus. Ou seja, por meio de ferramentas moleculares complementares foi possível identificar características moleculares espécie-específicas que, juntas, permitiram a identificação inequívoca das espécies de T. mesophaeus, T. nigromaculatus e T. typhonius. Nas árvores filogenéticas do gene ND2 cada uma das três espécies está representada por um grupo monofilético e com alto suporte. Em contrapartida, o gene COI não apoiou o monofiletismo da espécie T. mesophaeus e no gene tirosinase somente a espécie T. mesophaeus apresentou suporte estatístico. Numa análise concatenada dos genes, por sua vez, foi possível recuperar as três espécies com alto suporte estatístico, mostrando-se essa como uma eficiente estratégia para estudos de identificação molecular de espécies de Trachycephalus. Nas análises das árvores de genes foram considerados os aspectos da monofilia e suporte estatístico dos clados, porém deve-se levar em consideração que o DNA mitocondrial e o DNA nuclear apresentam características distintas que podem resultar em árvores de genes diferentes das árvores das espécies. De forma geral, árvores de genes mitocondriais tendem a ser mais congruentes com a árvore de espécies do que árvores de genes nucleares, devido ao fato de não haver recombinação no DNA mitocondrial, ao tipo de herança materna, à sua estrutura genética simples, às rápidas taxas de mutações e reduzido tamanho efetivo populacional (Ne) (Moore 1995; Avise 2000; Funk e Omland 2003). Devido às características intrínsecas do DNA nuclear, de apresentar menores taxas de substituição de nucleotídeos e maior tamanho efetivo populacional esse tipo de marcador recupera uma história filogenética mais antiga, pois ele coalesce em um tempo quatro vezes maior que o DNA mitocondrial (Avise 2000; Edwards e Beerli 2000; Moore1995). Nesse estudo, T. mesophaeus foi recuperado como um grupo mais basal e irmão de T. nigromaculatus e T. typhonius (T. mesophaeus (T. typhonius + T. nigromaculatus)). Devido 36 ao fato de T. mesophaeus ser a espécie mais basal dentre as três, não é discrepante a observação de esta ter sido a espécie com melhor resolução filogenética na tirosinase (que é um gene nuclear conservado), pois teve mais tempo de acumular mais mutações, o que a torna visivelmente distinta de T. nigromaculatus e T. typhonius (Pyron e Wiens 2013) (Figura 13). Figura 13. Relações filogenéticas entre oito espécies de Trachycephalus, incluindo T. mesophaeus, T. nigromaculatus e T. typhonius. Os valores sobre os ramos são os tempos de divergências dos clados e os valores em frente aos nós são o bootstrap da análise de Máxima Verossimilhança (Adaptado de Pyron e Wiens 2013). A relação entre as espécies de Trachycephalus foi congruente com uma proposta filogenética anterior na qual foram utilizadas sequências de três genes mitocondriais e nove exons nucleares (Pyron e Wiens 2013). Nesse estudo foram calculados os tempos de divergência entre as espécies e, assim como no nosso trabalho, T. mesophaeus apresentou-se como uma linhagem mais antiga e irmão a T. nigromaculatus e T. typhonius, que se agruparam como clados irmãos e as espécies mais recentes T. nigromaculatus de T. typhonius também apresentou baixo suporte na análise de MV. Dessa forma, pode-se sugerir que o resultado encontrado no presente estudo não se deve ao uso de um único marcador nuclear, uma vez que a inclusão de mais genes nucleares do mesmo tipo (exons) não contribuiu para 37 resolver a separação entre essas duas espécies. Talvez a utilização de outros tipos de marcadores nucleares, como os introns por exemplo, consiga melhorar a detecção de separação entre T. nigromaculatus e T. typhonius. Um dos métodos utilizados para identificar limites genéticos entre as espécies foi a distância genética, que é uma medida estatística de quantificação das diferenças genéticas entre grupos. Nos genes mitocondriais foram observados altos valores de distância genética entre as espécies (superiores a 10%) e baixos dentro das espécies (cerca de 2%). As espécies T. typhonius e T. nigromaculatus apresentaram divergência molecular superior a 12% tanto no COI quanto no ND2, assim como T. typhonius e T. mesophaeus e T. nigromaculatus e T. mesophaeus. Apesar de não terem sido observadas diferenças significativas entre os valores de distância genética entre os genes COI e ND2, recomenda-se a utilização de mais de um marcador mitocondrial para acessar os valores de distância genética intra e interespecíficos, pois esses podem apresentar taxas de evolução diferentes. As distâncias genéticas variaram de acordo com o gene e, no presente estudo, foram congruentes com a literatura que suscita que, em espécies de anuros, estas têm sido consideradas distintas quando apresentam distâncias iguais ou superiores a 10% tanto no gene COI (Vences et al. 2005a, Fouquet et al. 2007) quanto no gene ND2 (Crawford 2003). Outro gene muito utilizado em estudos de diversidade de anuros é o gene da subunidade maior do DNA ribossomal (rDNA 16S), que assume 5% de divergência entre espécies distintas (Vences et al. 2005a; 2005b) Os valores limites de divergência interespecíficos podem ser usados como uma ferramenta de identificação de espécies caso sejam altos o suficiente para ignorar o intervalo da divergência intraespecífica e baixos o suficiente para poder detectar espécies incipientes ou recentes (Fouquet et al. 2007). Apesar de serem bons indicadores preliminares de espécies candidatas (Vences et al. 2005a), outros dados devem ser levados em conta na identificação de espécies, não sendo indicado basear-se em apenas um fragmento de DNA, como foi a proposta do Barcode of Life (Hebert et al. 2003). Por exemplo, em estudo sobre diversidade de anuros, Jansen e colaboradores (2011) encontraram valores de cerca de 3% de divergência no gene rDNA 16S entre algumas populações geograficamente distantes de Trachycephalus cf. typhonius. Esse valor não indicaria uma nova espécie de acordo com valores de distância conhecidos para o gene rDNA 16S. No entanto, adicionalmente a esse resultado, foi levado 38 em conta o posicionamento e a distância genética desses indivíduos em análises de Agrupamentos de Vizinhos (Neighbor-Joining), levantando a possibilidade de se tratar de um complexo de espécies que divergiram recentemente. A tirosinase não apresentou valores de divergência que permitissem a identificação inequívoca das espécies de Trachycephalus aqui estudadas. Fouquet e colaboradores (2007) também obtiveram resultados similares relativos a esse gene ao estudar a diversidade críptica de grupos de anuros neotropicais. A terminologia barcode utilizada na biologia molecular é uma analogia de como é feita a identificação de produtos em lojas por meio de código de barras e foi utilizado pela primeira vez por Hebert e colaboradores (2003), com o objetivo de identificar espécies em larga escala por meio de pequenas sequências de DNA de um mesmo gene (≥500 pares de base). O gene COI foi proposto como barcode e na maioria dos casos estudados (˃95%) conseguiu identificar corretamente o organismo (Mitchell 2008). No entanto, esse gene pode falhar na descoberta de novas espécies, especialmente se elas divergiram recentemente e não acumularam diferenças fixas em suas sequências do COI; nos casos de hibridização interespecífica e sorteamento incompleto de linhagens (Funk e Omland 2003). Outro problema na utilização de sequências como barcode é a dependência de se ter sequências de referência depositadas no GenBank para comparação de similaridade, sendo que é notória a grande quantidade de identificações erradas no mesmo (Shen et al. 2013). No entanto, há esforços para tentar identificar esses erros, sendo uma delas o Cold Code (Murphy et al. 2013), que é uma iniciativa global de identificar todas as espécies de répteis e anfíbios por meio de código de barras de DNA e procura sugerir correções ao GenBank. Deste modo, pode-se dizer que o DNA barcoding é útil, não só para identificar espécies, mas pode ter um importante papel em detectar e reparar possíveis erros no GenBank (Shen et al. 2013). Um outro método de análise abordado no presente estudo, redes de haplótipos, permitiu visualizar a separação das linhagens correspondentes às espécies. Os haplogrupos referentes às espécies ficaram separados entre si por um elevado número de passos mutacionais (> 40) nos genes mitocondriais, indicando que muitas diferenças genéticas foram acumuladas entre as espécies e evidenciam a separação entre as linhagens. As múltiplas conexões observadas na rede de haplótipos da tirosinase podem ser devido à recombinação nesse gene. Na rede de haplótipos do gene nuclear os haplogrupos das espécies ficaram separados por poucos passos mutacionais e mais uma vez T. mesophaeus apresentou-se como 39 um agrupamento mais distante em relação a T. typhonius e T. nigromaculatus, porém as espécies ficaram separadas completamente. Assim como na filogenia e na distância genética, na rede de haplótipos do gene nuclear as espécies T. typhonius e T. nigromaculatus apresentaram-se proximamente relacionadas. Uma rede de haplótipos é uma rede filogenética não-enraizada na qual os nós representam haplótipos ou alelos em um grupo de táxons proximamente relacionados ligados entre si de acordo com a similaridade das sequências dos haplótipos (Hudson et al. 2010). Por isso, as redes de haplótipos observadas no presente estudo apresentaram resultados semelhantes aos observados nas filogenias. A quantidade de passos mutacionais nos genes mitocondriais que separaram as espécies no presente estudo foi equivalente a outros estudos de espécies congenéricas de anuros (Greenbaum et al. 2011) ou maior (Fouquet et al. 2007; Bryson et al. 2010; Orozco-Terwengel et al. 2013) Verifcou-se ainda que os polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) nos genes mitocondriais foram eficientes para identificar cada uma das três espécies de Trachycephalus, apresentando elevada quantidade de polimorfismos. Os SNPs são promissores marcadores moleculares que representam o tipo mais difundido de variação no DNA em vertebrados (Slate 2009) e por isso vêm sendo amplamente utilizados para a identificação de espécies de interesse econômico (Ackerman et al. 2011; Bradbury et al. 2011) e também consequentemente assinalar os parentais envolvidos em casos de suspeitas de hibridização (Kalinowski 2010; Lammers et al. 2012; Shen et al. 2012). Além da alta divergência interespecífica encontrada no COI, esse gene mostrou um aumento de um terço do número de SNPs em relação ao gene ND2 e, apesar do tamanho da sequência do COI ser menor que o ND2. Com relação à tirosinase, a quantidade de SNPs foi muito pequena, o que já era esperado devido ao fato deste ser um gene nuclear, embora nesse gene tenha sido possível identificar SNPs específicos de T. mesophaeus e T. nigromaculatus, sendo possível identificar T. typhonius somente quando comparado às duas espécies. Da mesma forma que muitos estudos de identificação de espécies mostraram que se basear em apenas um critério, como morfologia, por exemplo, não é adequado (Lamb e Avise 1987; Mitchell e Samways 2005; Garofalo et al. 2012), o presente estudo permite concluir que utilizar sequências de apenas de um gene mitocondrial pode não refletir a diversidade de 40 espécies de um gênero. O gene COI não seria adequado para a identificação de T. mesophaeus, seguindo o critério da monofilia, porém seria considerada uma espécie de acordo com o critério da distância e pelos SNPs. Dessa forma, para resolver problemas taxonômicos, ressalta-se a importância de se utilizar mais de um marcador mitocondrial, de preferência que apresente taxas de evolução mais rápidas que o COI (Che et al. 2012), mesmo que geralmente os genes mitocondriais reflitam de forma similar as histórias filogenéticas. A identificação de SNPs e averiguação das distâncias genéticas mostraram ser boas ferramentas moleculares para a identificação das três espécies de Trachycephalus. Além disso, concatenar os genes mostrou ser uma alternativa adequada para dar maior robustez às inferências observadas nas árvores dos genes isolados, uma vez que análises de DNA mitocondrial geralmente são congruentes com análises derivadas de genes nucleares quando há suficiente amostragem dos taxa e análises filogenéticas adequadas são utilizadas (Reyes et al. 2004; Kjer e Honeycutt 2007). O gene ND2 foi o gene que apresentou melhor resolução nas análises filogenéticas, recuperando as três espécies de Trachycpehalus. Além dessas características, o ND2 é o único gene com taxa de mutação conhecida para anfíbios, sendo amplamente utilizado em estudos de biogeografia (Crawford 2003; Evans et al. 2004; Carnaval e Bates 2007; Tonini et al. 2013; Thome et al. 2012). Em estudo recente Zhang e colaboradores (2013) classificaram o gene ND2 como um dos cinco genes mais informativos e que oferecem melhor resolução filogenética em estudos de biodiversidade de anuros, sendo melhor inclusive que os genes rDNA 12S e COI. Neste estudo foi recomendado o gene rDNA 16S como primeira escolha como barcode de anfíbios, seguido do ND2, e não a análise conjunta do rDNA 16S e o COI, como previamente proposto por Vences e colaboradores (2005). Dessa forma, o presente estudo comprovou as vantagens de se utilizar o gene ND2 em relação ao COI, recomendando-se a ampla utilização desse gene em estudos acerca da biodiversidade de anuros. A delimitação das espécies no presente estudo foi baseada em critérios que evidenciassem a separação de linhagens, seguindo o conceito de espécie de De Queiroz (2007) que prediz que espécies são linhagens que evoluem separadamente de outras linhagens. Os critérios operacionais ou linhas de evidência relevantes para avaliar a separação 41 de linhagens foram a monofilia recíproca, divergência genética, distância de haplogrupos e identificação de SNPs espécie-específicos. Segundo os critérios abordados pode-se concluir que T. mesophaeus, T. nigromaculatus e T. typhonius são espécies distintas, por apresentarem evidências que cada uma corresponde a uma linhagem que evolui independentemente. Trachycephalus typhonius da Foz do rio Amazonas Dois exemplares do Pará, um da Ilha de Marajó e outro de Oriximiná (aqui denominados Clado Marajó), identificados pelos coletores como T. typhonius, apresentaram características genéticas que os diferenciaram dos demais T. typhonius. Na árvore filogenética dos genes concatenados recuperou-se esse clado como um grupo irmão aos demais exemplares de T. typhonius, com um ramo profundo separando-os de todos os outros exemplares e com altos valores de suporte e probabilidades posteriores (ambos acima de 95). Além disso, ao analisar as sequências para identificar SNPs espécie- específicos esses indivíduos apresentavam nucleotídeos distintos de todos os outros T. typhonius. Se esses dois indivíduos tivessem sido retirados da amostra, teriam sido amostrados vinte SNPs a mais no ND2, seis no COI e na tirosinase não haveria alterações. Na rede de haplótipos do gene ND2 o clado Marajó apresentou distância de 31 passos mutacionais dos demais T. typhonius, o que foi equivalente à quantidade de passos mutacionais que separou T. mesophaeus de T. nigromaculatus (36 passos mutacionais). Por outro lado, no gene COI foi analisado o indivíduo da Ilha de Marajó e não foi observada essa disparidade de passos mutacionais dentro do haplogrupo de T. typhonius (4 passos). Nos testes de divergência genética considerando essas duas amostras como um grupo à parte os resultados indicaram 9% de divergência em relação aos demais T. typhonius no gene ND2, 2% no COI e 1% no TYR. Essas duas amostras contribuem com 30% da diversidade de T. typhonius no ND2 e 10% no COI. Estudos envolvendo o gene COI sugeriram para anfíbios o valor de 10% para divergência entre espécies, porém seriam aceitáveis valores menores para espécies proximamente relacionadas (Vences et al. 2005a, Vences et al. 2005b; Fouquet et al. 2007). 42 Uma possível interpretação é de que esses exemplares do clado Marajó correspoindam a T. hadroceps (Duellman e Hoogmoed, 1992), uma espécie-irmã de T. typhonius, com ocorrência na Guiana, Guiana Francesa e Suriname (Frost 2014), que ficam próximos à foz do rio Amazonas, onde os exemplares do clado Marajó foram coletados. No entanto, recentemente foram descritas duas novas espécies amazônicas de Trachycephalus, que até então eram consideradas variações morfológicas de T. resinifictrix (Goeldi, 1907) e T. hadroceps. As descrições das espécies T. cunauaru (Gordo et al. 2013) e T. helioi (Nunes et al. 2013) foram baseadas em características morfológicas e de vocalização, embora em ambos os casos não tenham sido utilizados dados genéticos, o que poderia contribuir para a identificação dos exemplares do clado Marajó. No entanto, a verificação da morfologia dos exemplares do clado Marajó poderá sanar essas dúvidas e, se confirmadas as identidades dos indivíduos, poderá aumentar a quantidade de localidades em que essas novas espécies de Trachycephalus são conhecidas. Esses resultados mostram que a identificação morfológica pode estar mascarando mais de uma unidade evolutivamente significativa, e que dados moleculares devem ser analisados com cautela, principalmente quando podemos estar tratando de espécies que divergiram recentemente, não sendo adequado nos atermos a valores fixos de divergência genética determinados. Hibridação em Trachycephalus Pela primeira vez na literatura verificou-se a introgressão de espécies de Trachycephalus baseando-se de dados obtidos exclusivamente por estudos moleculares. Mais especificamente encontramos que: i) as três espécies são altamente divergentes em nível mitocondrial, o que foi observado no DNA nuclear somente para T. mesophaeus e ii) as discordâncias entre o DNAmt e o DNAn são mais facilmente explicáveis pela hibridização interespecífica (atual ou pretérita) e não pela retenção de polimorfismos ancestrais (Incomplete Lineage Sorting, ILS). Quando a divergência entre as espécies é antiga é esperado que as genealogias reflitam a história de divergência entre as espécies. No entanto, são frequentes os casos em http://research.amnh.org/vz/herpetology/amphibia/Amphibia/Anura/Hylidae/Hylinae/Trachycephalus/Trachycephalus-hadroceps 43 que as genealogias não refletem a história de divergência esperada (Nunes et al. 2010; Zielinski et al. 2013). Um processo que tem a capacidade de modificar de maneira contundente e parcialmente apagar a assinatura genética de isolamento pretérito é a hibridização, um processo comum para aproximadamente 25% das plantas e 10% dos animais (Mallet 2005). Ao considerar espécies como linhagens distintas em níveis populacionais ou metapopulacionais (Mayden 1997; de Queiroz 2007) admite-se que possa ocorrer hibridização e fluxo gênico entre espécies desde que esses fenômenos sejam suficientemente raros de modo que a linhagens evolutivas independentes não se fundam em uma só linhagem. A hibridização, em particular, ocorre provavelmente durante os primeiros estágios da especiação, quando as espécies recém-separadas ainda não acumularam diferenças suficientes para prevenir seu intercruzamento (Wu e Ting 2004). O ILS ocorre quando vários eventos de especiação ocorrem em curto período de tempo e se, para algum gene, o polimorfismo ancestral não for completamente resolvido em duas linhagens monofiléticas quando a segunda especiação ocorrer, então há a possibilidade da árvore de genes ser diferente da árvore de espécies (Tajima 1983; Pamilo e Nei 1988). O ILS em nível de espécie resulta em uma espécie sendo parafilética ou polifilética em uma árvore de genes (Funk e Omland 2003). Dessa forma, se um determinado gene em estudo não tiver alcançado a coalescência em nível de espécie, algumas linhagens de uma espécie podem ficar mais proximamente relacionadas a linhagens de outra espécie que não a sua. Esse problema é particularmente pronunciado em espécies que divergiram recentemente ou em genes de evolução lenta, como muitos genes nucleares (Chen et al. 2009). Dentre os onze indivíduos que se mostraram inconsistentes com a identificação da linhagem materna e paterna nos genes mitocondriais e nuclear, somente os quatro indivíduos da Serra, Espírito Santo, apresentaram identificação morfológica prévia dúbia ou intermediária. Essa característica foi levantada por Hubbs (1955) como uma “regra quase universal de que híbridos interespecíficos são intermediários entre suas espécies parentais em todas as características que as diferem” e se tornou uma ferramenta morfométrica padrão para avaliar suspeitas de hibridização em muitas espécies. No entanto, estudos demonstraram que caracteres morfológicos usados para distinguir espécies parentais podem não ser uniformemente intermediários em híbridos, sendo que a prole pode apresentar maior 44 similaridade com uma das espécies parentais (Wu et al. 2011). Por outro lado, estudos recentes têm demonstrado que analisar somente a morfologia pode levar à conclusões premeditadas sobre a existência de indivíduos híbridos, que na verdade podem representar variações morfológicas intraespecíficas (Garofalo et al. 2012) e que ferramentas moleculares são fundamentais para desvendar histórias evolutivas complexas entre espécies (Machado e Hey 2003; Good et al. 2008; Sequeira et al. 2011; Thomé et al. 2012; Zielinski et al. 2013). A primeira hipótese era que esses indivíduos de Trachycephalus de morfologia intermediária fossem híbridos entre T. mesophaeus e T. nigromaculatus, por essas serem as únicas espécies do gênero com registro no Espírito Santo (Almeida et al. 2011) e por existirem relatos de indivíduos morfologicamente intermediários entre essas espécies em local onde ocorrem em simpatria (Ramos e Gasparini 2004). No entanto, as análises do presente estudo confirmaram que esses espécimes apresentam DNA mitocondrial de T. typhonius, como previamente indicado por Matedi e colaboradores (2010), o que é um fato curioso já que essa espécie ocorre em todos os estados brasileiros, exceto o Espírito Santo (Haddad et al. 2013). Essa provável ausência de registros pode ser devido à falta de um maior esforço amostral, já que é intrigante explicar como uma espécie que ocorre desde o México até o norte da Argentina não esteja presente somente nos limites geográficos do estado do Espírito Santo, com registro nos estados vizinhos. Dessa forma, a explicação mais parcimoniosa baseada nas evidências morfológicas (características intermediárias) e moleculares (identificação nuclear de T. nigromaculatus pelos SNPs e árvore filogenética) favorece a explicação que as incongruências citonucleares observadas nos indivíduos da Serra, Espírito Santo, sejam devido à hibridização introgressiva de T. typhonius e T. nigromaculatus. Além disso, a morfologia intermediária é um indício de hibridização recente, portanto, isso levaria a crer que existe T. typhonius no Espírito Santo, apesar de indivíduos “puros” ainda não terem sido registrados no estado. Além dos quatro indivíduos do Espírito Santo, outros sete indivíduos cujas amostras de tecidos foram doadas por pesquisadores foram identificados como potenciais híbridos, por serem identificadas espécies parentais diferentes no DNA mitocondrial e no DNA nuclear. Esses indivíduos não apresentavam morfologia duvidosa, informação confirmada com os curadores das coleções. Esse resultado poderia ser um indício de que esses indivíduos seriam 45 híbridos introgressivos, ou seja, que retrocruzaram com suas espécies parentais e tiveram suas características morfológicas deslocadas para um extremo. As espécies T. mesophaeus e T. nigromaculatus ocorrem em simpatria nas localidades das amostras CFBH9156 (Jequié-Bahia) e MTR12040 (Linhares-Espirito Santo). Nesses dois exemplares o DNAmt identificado foi de T. nigromaculatus e o DNAn foi de T. mesophaeus. Nesses casos a hipótese de hibridização é favorecida em relação à ILS, pois distribuições simpátricas favorecem cruzamentos interespecíficos (Donnelly et al. 2004). Além disso, se fosse o caso de ILS, o padrão de compartilhamento de haplótipos entre essas duas espécies deveria ser encontrado uniformemente nessas regiões de simpatria (Ballard 2000), o que não foi observado nas demais amostras de Linhares, Jequié e proximidades Além disso, o clado correspondente à T. mesophaeus foi o que apresentou maior confiabilidade estatística nas análises filogenéticas e mais características moleculares que permitiram diferencia-la das demais espécies no gene nuclear (i.e. mais SNPs espécie-específicos e maior divergência em relação às outras espécies). Foi identificado um exemplar (MTR22113) com DNAmt de T. mesophaeus e DNAn de T. nigromaculatus em Wenceslau Guimarães, que fica a cerca de 100km de Jequié, Bahia. Nesse caso também as possíveis espécies parentais ocorrem em simpatria e a hipótese de introgressão é favorecida em relação à ILS. Com isso, pode-se concluir que ocorre introgressão bidirecional entre as espécies T. mesophaeus e T. nigromaculatus. Três indivíduos foram identificados com DNAmt de T. nigromaculatus e DNAn de T. typhonius, sendo um do Piauí (MTR2815) e dois de Minas Gerais (MTR509 e MTR510). Não há registros de T. nigromaculatus no Piauí, porém, a ocorrência dessa espécie é conhecida nos estado da Bahia e Pernambuco (Haddad et al. 2013), que são adjacentes ao Piauí, sendo provável que essa espécie ocorra na localidade onde o potencial híbrido foi coletado. Nesse indivíduo, os alelos nucleares agruparam-se com espécies distintas (T. nigromaculatus e T. typhonius), o que pode sinalizar que se trata de um indivíduo da primeira geração F1. Os indivíduos de Januária, Minas Gerais, ocorrem em área de simpatria entre as potenciais espécies parentais, o que pode apoiar a hipótese de hibridização. Como foi identificada a situação citonuclear inversa nos espécimes da Serra, ES, pode-se sugerir que ocorre introgressão bidirecional entre as espécies T. typhonius e T. nigromaculatus. 46 O exemplar MTR5003 da Chapada dos Guimarães, Mato Grosso, apresentou DNAmt de T. typhonius, enquanto que um alelo do DNAn agrupou-se com T. nigromaculatus e o outro com T. typhonius, o que pode também sinalizar que se trata de um indivíduo F1. No entanto, nesse caso, não há registro de ocorrência de T. nigromaculatus no Mato Grosso, mas há registros para Goiás, que é adjacente ao Mato Grosso (Haddad et al. 2013). Dessa forma, é possível que essa espécie ocorra na localidade onde o potencial híbrido foi coletado. Os resultados do presente estudo reforçam que a não-monofilia tanto em genes nucleares como em mitocondriais é mais comum do que é geralmente reconhecido (Funk e Omland 2003; Broughton e Harrison 2003; Machado e Hey 2003; Sequeira et al. 2011; Thomé et al. 2012). Hibridização é o cruzamento entre indivíduos de espécies diferentes (F1) e introgressão é a transferência de genes entre espécies mediada primariamente por retrocruzamentos (F2 ou posterior). A hibridização introgressiva tem sido o foco de estudos evolutivos por muitas décadas e um dos maiores desafios teóricos acerca do tema é provar que o padrão observado de compartilhamento de alelos entre espécies é produto de introgressão e não um processo não contemporâneo, como o sorteamento incompleto de polimorfismos ancestrais (Twyford e Enos 2012). Apesar de um rigoroso enfoque estatístico ser geralmente necessário para distinguir retenção de polimorfismo ancestral de introgressão (Peters et. al. 2007), três abordagens principais têm sido comumente usadas para delinear as hipóteses conflitantes quando os pré- requisitos para um teste estatístico não são atendidos (i. e. poucas amostras por população) e foram sumarizados por Zakharov (2009): 1. Examinar a topologia das árvores do DNA mitocondrial serve como um método heurístico para revelar a causa da parafilia (Baker et al. 2003). Pouca divergência, com pouca resolução e ausência de clados distintos indicam retenção de polimorfismo ancestral ou especiação recente. No presente estudo os clados do ND2 apresentaram-se bem distintos, com alto suporte e com ramos profundos, além de as espécies apresentarem alta divergência genética entre elas. 2. A comparação entre árvores de DNA nuclear e DNA mitocondrial geralmente apoiam a hipótese de retenção de polimorfismo ancestral se padrões de 47 polimorfismos compartilhados e parafilia forem observados entre os genomas (Ballard 2000). No presente estudo foram observados padrões de polimorfismos compartilhados e parafilia entre o DNAn e DNAmt, sendo que os indivíduos discordantes nas análises foram pontuais na amostra. 3. A hipótese de hibridização é favorecida em relação à retenção de polimorfismo ancestral se distribuições simpátricas permitirem cruzamentos interespecíficos (Donnelly et al. 2004). Na maioria dos casos observados no presente estudo as espécies envolvidas ocorrem em simpatria. Dessa forma, os resultados de incongruências no DNAmt e DNAn identificados em alguns indivíduos de Trachycephalus encontram grande apoio para serem interpretados como hibridização introgressiva bidirecional, tendo T. nigromaculatus como o parental em comum aos híbridos de T. mesophaeus e T. typhonius. Os indivíduos introgressivos foram identificados em áreas que as espécies ocorrem em simpatria (ou são potencialmente simpátricas) e, em grande parte dos casos, não teriam sido descobertos, se não fosse a identificação molecular. Conclusões 1. Trachycephalus mesophaeus, T. nigromaculatus e T. typhonius são espécies distintas bem caracterizadas geneticamente e atenderam aos critérios estipulados para testar a validade das espécies. 2. Para estudos de identificação molecular no gênero Trachycephalus não se recomenda a utilização do gene COI, devido à dificuldade em recuperar as três espécies somente com esse gene. Por outro lado, o gene ND2, que não é o mais usado para estudos em anuros, foi o gene que melhor contribuiu para o entendimento das relações entre os indivíduos e as espécies. 3. A utilização da tirosinase, que é um gene de evolução lenta, apresentou bons resultados nas análises concatenadas. Quando analisado isoladamente esse gene diferenciou com clareza T. mesophaeus das demais espécies, provavelmente por essa ser a espécie mais antiga das três, e não apresentou 48 resolução estatística da separação das espécies T. nigromaculatus e T. typhonius, que são espécies mais recentes. 4. Para a identificação de indivíduos sugere-se a utilização de marcadores nucleares mais conservados (i. e. tirosinase) e mais variáveis (introns ou microsatélites, por exemplo), com diferentes taxas de mutação e que, em conjunto possam refletir a história das espécies. 5. Os SNPs foram altamente eficientes em identificar as espécies e potenciais híbridos. Essa ferramenta é pouco utilizada em estudos com anfíbios e recomenda-se sua identificação em genes nucleares e mitocondriais. 6. No caso de identificação de DNAn de T. mesophaeus a hipótese de hibridação foi apoiada indubitavelmente por todas as análises no presente estudo. Quando identificadas as espécies T. nigromaculatus ou T. typhonius no DNAn, todas as metodologias abordadas tiveram que ser levadas em consideração, sendo que o conjunto dos dados foram informativos, principalmente os SNPs. 7. A identificação de indivíduos híbridos F1 (primeira geração) e introgressivos (gerados por retrocruzamento) em Trachycephalus em localidades onde não há registros de uma das espécies parentais ampliam o panorama para estudos ev